RSS订阅

实验方法

基于胚胎干细胞的同源重组技术

2018年11月05日 浏览量: 评论(0) 来源:百奥赛图 作者:百奥赛图 责任编辑:admin
摘要:基因改造(包括敲除和敲进)小鼠已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的实验动物模型,在生命科学、人类医药和健康研究领域中发挥着重要的作用。今天呢,就给大家介绍最传统最稳定的基因改造技术:基于胚胎干细胞的同源重组技术。

基因改造(包括敲除和敲进)小鼠已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的实验动物模型,在生命科学、人类医药和健康研究领域中发挥着重要的作用。今天呢,就给大家介绍最传统最稳定的基因改造技术:基于胚胎干细胞的同源重组技术。

Capecchi和Smithies早在在1989年根据同源重组(homologous recombination)的原理,首次实现了ES的外源基因的定点整合(targeted integration),即"基因打靶"(gene targeting),如果用外源抗性基因将基因上的一段重要序列替换掉,就成功将目的基因实现了基因敲除(gene knockout),利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠(KO Mice: knockout mice);由于这一工作,Capecchi和Smithies于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。

图片来源:https://www.nobelprize.org/prizes/medicine/2007/summary/

是不是感觉很高级?那么,问题来了:到底什么是同源重组呢?

首先,我们先了解一下什么是同源重组技术:

同源重组(homologous recombination):是指发生在姐妹染色单体(sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。在基因改造小鼠制作过程中,需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重组载体,将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组,简言之,就是把想改造的部分各制备一段一模一样的DNA序列(同源臂),然后同源臂之内的部分就会被替换掉了,如图1所示:

图片来源:Jun. , 2006 Vol . 14 No. 2中国实验动物学报

 

了解了同源重组技术的原理,那基于该原理,如何制备出基因改造小鼠呢?接下来我们以基因敲除为例,为大家详细介绍一下基因敲除小鼠的制备流程:

 

2.  基因敲除制备过程示意图

图片来源:https://www.nobelprize.org/prizes/medicine/2007/press-release/

1、打靶载体设计与构建
首先,第一步,要进行打靶载体的设计及构建。是将目的基因、与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 片段,都重组到带有标记基因(如neoR基因,TK 基因等)的载体上,成为重组载体。简言之,就是把一个抗性基因插入到同源臂的两端,利用“同源重组”把同源臂中的抗性基因替换到基因组对应同源臂中去。

同源臂内的抗性基因(我们一般用新霉素抗性基因,即有G418抗性,又名NeoR),我们一般叫“正筛选标记”,打靶载体同源臂外部分我们也会加入一个致死基因,叫“负筛选标记”。这两个筛选标记是干什么用的呢?这里我们先卖个关子,稍后再做详解~

图3.原理图

来源:Jun. , 2006 Vol . 14 No. 2中国实验动物学报

2、电转导入打靶载体

打靶载体制备完成后,重组载体通过电转的方法,导入同源小鼠胚胎干(EScell)中,使外源DNA与胚胎干胞基因中相部分同源重G418筛选转染后的胚胎干细胞,得到阳性克隆 。

 

3、ES细胞筛选

由于基因转移的同源重组自然发生率极低,动物的重组概率为10-2~10-5,植物的概率为104~10-5

那么,既然同源重组率这么低,如何确保筛到正确重组的阳性克隆呢?

还记得我们上文提到的打靶载体上的“正筛选标记”和“负筛选标记”吧?替换目的基因(或重要区域)的同时,插入一个抗性基因,即“正筛选标记”,可以确保得到ES细胞克隆中已经进行了重组;在打靶载体上同源臂外插入一个致死基因,即“负筛选标记”,可以防止打靶载体随机插入造成的假阳性。正负筛选标记综合起来,基本上可以确保拿到的ES克隆是打靶载体两端通过同源重组插入的了,是不是很聪明呢?

当然即使通过正负筛选标记,得到的阳性克隆仍然有可能跟理想的插入有个别碱基或片段的出入,因此就需要进一步通过基因组PCR并测序和southern blot杂交技术(基因敲除小鼠检测金标准)对上一步得到的阳性克隆进行筛选,最终得到稳定整合外源基因的胚胎干细胞阳性克隆,然后,将阳性克隆扩大培养并液氮保存。

图片来源:http://orthodoxnet.com/blog/2011/06/to-be-or-not-to-be-created/

4、ES细胞囊胚注射得到嵌合体小鼠

经历千辛万苦以后,我们终于得到了正确重组的ES细胞阳性克隆!

下面就是要将ES阳性克隆以囊胚显微注射的方式将注入特定品系小鼠囊胚中,然后将囊胚移植到代孕的小鼠子宫中。等待后代小鼠出生后,我们就可以通过观察小鼠的毛色比例(通常我们选用的ES细胞是黑色C57BL/6小鼠背景,而囊胚供体是白色balb/c背景),来判断嵌合程度的高低,以及该小鼠的后代中可能获得生殖系传递能力。

5、得到嵌合鼠,并获得F1阳性杂合子小鼠
将嵌合体小鼠与适当品系的小鼠交配,后代小鼠出生后,通过PCR方式来检测小鼠是否含有打靶序列。如有,则该小鼠就是具备生殖遗传能力的F1代鼠了哦!

经过这一番介绍,大家对基于胚胎干细胞的同源重组技术是不是有了初步了解了呢?

百奥赛图是国内最早使用近交系C57BL/6胚胎干细胞进行基因打靶,并且承诺实验失败全额退款的公司,我们自信,在基因改造小鼠方面,我们很专业!

想要了解更多细节,或者想要定制您自己的小鼠?欢迎随时跟我们联系!

 

扫码关注百奥赛图了解更多干货

 

相关文章
  • 没有相关内容!
点击这里给我发消息 点击这里给我发消息 点击这里给我发消息